产品货号：
BTN15-64320
中文名称：
单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR试剂盒(探针法)
英文名称：
Listeria monocytogenes Probe qPCR Kit
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测单核细胞增生李斯特菌的试剂盒。
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌，革兰氏阳性小杆菌。单增李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。因为本菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能。因此，李氏杆菌病主要于新生儿、老人以及免疫功能低下者。单核细胞增生李斯特氏菌主要通过粪一口途径感染，还可通过眼及破损皮肤、黏膜进入体内而造成感染。因此快速检测单核细胞增生李斯特菌具有重要的意义。
保存：-20℃，有效期2年。
引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
一、稀释标准曲线样品(以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本制品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
二、样品DNA的制备
三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
四、数据处理
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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌，革兰氏阳性小杆菌。单增李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。因为本菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能。因此，李氏杆菌病主要于新生儿、老人以及免疫功能低下者。单核细胞增生李斯特氏菌主要通过粪一口途径感染，还可通过眼及破损皮肤、黏膜进入体内而造成感染。因此快速检测单核细胞增生李斯特菌具有重要的意义。
- 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
- 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
- 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
- 特异性高，引物是根据单核细胞增生李斯特菌DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
- 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
- 本制品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
- 本制品只能用于科研。
| 组分 | 规格 |
| 2×Probe qPCR MasterMix | 0.5mL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 超纯水 | 1mL |
| 单核细胞增生李斯特菌qPCR引物-探针干粉 | 50次 |
| 单核细胞增生李斯特菌qPCR阳性对照(1×107拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期2年。
引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
一、稀释标准曲线样品(以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本制品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
- 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
- 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
- 在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在4号管中加入5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
- 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
- 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
成分 样品管
N+2个PCR阴性
对照标准曲线样品管
(1～6管)2×Probe qPCR MasterMix 各10μL 10μL 各10μL 单核细胞增生李斯特菌qPCR引物-探针混合液 各3μL 3μL 各3μL N+2个待测DNA样本 各7μL 不加 不加 超纯水 不加 7μL 不加 第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号) 不加 不加 各7μL - 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程 温度 时间 预变性 95℃ 10min PCR反应
(45个循环)95℃ 15sec 63℃ 60sec(采集FAM通道的荧光信号，设置TAMRA为淬灭基团)
四、数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
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